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黑木耳凝集素的分离、纯化及抗肿瘤活性研究
来源:黑龙江大学自然科学学报
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作者/编辑:马成瑶
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发布时间: 2019-08-01
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黑木耳是常见的食用菌，不仅营养丰富，还具有众多的生物活性。近年来对黑木耳多糖研究较多，对于其他成分研究较少，因此，本文利用( NH4 ) 2 SO4沉淀和亲和层析的方法提取到黑木耳凝集素，对其性质和抗肿瘤活性进行了初步探讨。结果表明，黑木耳凝集素耐酸，不耐碱，不具备热稳定性，具有糖特异性; 对肺癌( A549) 和乳腺癌细胞( MCF-7) 都有抑制性。此研究为今后黑木耳凝集素的活性研究提供基础。
0 引 言
黑木耳( Auricularia auricula ( L． ex Hook． ) Underwood) 是一种药食同源真菌，在生物分类系统中属于真菌界、担子菌门、伞菌纲、木耳目、木耳科、木耳属。黑木耳中含有丰富的营养成分，如糖类［1］、脂类化合物［2］、氨基酸［3］、蛋白质、黑色素［4］等。其中糖类约占 65% ，是黑木耳最主要的营养成分。凝集素是一种糖蛋白或可以与糖结合的蛋白质，因其可以凝集红细胞，使红细胞呈网状沉降，故称为凝集素［5］。自然界中的凝集素分布广泛，小到微生物，大到动物、植物，均含有凝集素。凝集素的提取可以按照普通蛋白分离的步骤进行，最常用的是硫酸铵沉淀，通过比较各组分的蛋白提取量，选择最优条件作为提取的最佳方法。草菇凝集素可用 PBS 浸提、硫酸铵沉淀、DEAE-52 纤维素离子交换层析、Sephadex G-75 凝胶过滤层析的方法［6］。阿魏菇凝集素可用 PBS 浸提、硫酸铵沉淀、DEAE-cellulose、Sepharose 4B 等柱层析的方法［7］。张迪等从双胞蘑菇子实体中纯化得到分子量为 15． 7 kDa 的单亚基凝集素，并发现该凝集素具有很好的热稳定性［8］。陈建华等从药用真菌桑黄发酵液中分离纯化得到分子量约为 24 kDa 的单亚基凝集素［9］。尹昭华等从柳蘑中分离纯化得到分子量约为 32 kDa 的双亚基凝集素［10］。
早期报道的凝集素可以凝集细胞，尤其对肿瘤细胞有特定的识别作用，通常作为探针结合肿瘤细胞表面的糖分子，起到靶向定位的作用。随着研究的深入，人们发现凝集素在抑菌［11］、抗肿瘤［12 － 13］和免疫调节［14］等方面均有着不可忽视的作用。从猴头菇中纯化得到的分子量为 51 kDa 的凝集素，能够抑制人肝癌 HepG2和人乳腺癌 MCF-7 细胞的增殖［15］。从杨树菇中分离的凝集素，可以抑制胃癌细胞和人急性白血病细胞［16］。从大白菇及正红菇提取的凝集素也具有抑制肿瘤细胞的功效［17］。从牛舌菇提取的凝集素具有抑制 HeLa 细胞的功效［18］。黑木耳凝集素能抑制肿瘤增殖，可作为临床癌症治疗的先导化合物，也可用于保健品和化妆品的生产。本文期望从黑木耳中提取出凝集素，并对其性质尤其是抗肿瘤活性进行研究，为进一步开发黑木耳的药用价值提供理论基础，为黑木耳食用、药用生产加工提供更广阔的应用前景。
黑木耳( Auricularia auricula ( L． ex Hook． ) Underwood) 是一种药食同源真菌，在生物分类系统中属于真菌界、担子菌门、伞菌纲、木耳目、木耳科、木耳属。黑木耳中含有丰富的营养成分，如糖类［1］、脂类化合物［2］、氨基酸［3］、蛋白质、黑色素［4］等。其中糖类约占 65% ，是黑木耳最主要的营养成分。凝集素是一种糖蛋白或可以与糖结合的蛋白质，因其可以凝集红细胞，使红细胞呈网状沉降，故称为凝集素［5］。自然界中的凝集素分布广泛，小到微生物，大到动物、植物，均含有凝集素。凝集素的提取可以按照普通蛋白分离的步骤进行，最常用的是硫酸铵沉淀，通过比较各组分的蛋白提取量，选择最优条件作为提取的最佳方法。草菇凝集素可用 PBS 浸提、硫酸铵沉淀、DEAE-52 纤维素离子交换层析、Sephadex G-75 凝胶过滤层析的方法［6］。阿魏菇凝集素可用 PBS 浸提、硫酸铵沉淀、DEAE-cellulose、Sepharose 4B 等柱层析的方法［7］。张迪等从双胞蘑菇子实体中纯化得到分子量为 15． 7 kDa 的单亚基凝集素，并发现该凝集素具有很好的热稳定性［8］。陈建华等从药用真菌桑黄发酵液中分离纯化得到分子量约为 24 kDa 的单亚基凝集素［9］。尹昭华等从柳蘑中分离纯化得到分子量约为 32 kDa 的双亚基凝集素［10］。
早期报道的凝集素可以凝集细胞，尤其对肿瘤细胞有特定的识别作用，通常作为探针结合肿瘤细胞表面的糖分子，起到靶向定位的作用。随着研究的深入，人们发现凝集素在抑菌［11］、抗肿瘤［12 － 13］和免疫调节［14］等方面均有着不可忽视的作用。从猴头菇中纯化得到的分子量为 51 kDa 的凝集素，能够抑制人肝癌 HepG2和人乳腺癌 MCF-7 细胞的增殖［15］。从杨树菇中分离的凝集素，可以抑制胃癌细胞和人急性白血病细胞［16］。从大白菇及正红菇提取的凝集素也具有抑制肿瘤细胞的功效［17］。从牛舌菇提取的凝集素具有抑制 HeLa 细胞的功效［18］。黑木耳凝集素能抑制肿瘤增殖，可作为临床癌症治疗的先导化合物，也可用于保健品和化妆品的生产。本文期望从黑木耳中提取出凝集素，并对其性质尤其是抗肿瘤活性进行研究，为进一步开发黑木耳的药用价值提供理论基础，为黑木耳食用、药用生产加工提供更广阔的应用前景。
1 实验部分
1． 1 动物细胞、材料与试剂
黑木耳采摘自黑龙江省牡丹江市东宁市三岔口镇，A549 肺癌细胞和 MCF-7 乳腺癌细胞均购自上海中科院细胞库。BCA 蛋白浓度测定试剂盒( P0012) 和 MTT 试剂盒( C0038) 购自北京碧云天生物技术研究所; 无菌脱纤维兔血( HQ50073) 购自广州鸿泉生物科技有限公司; ＲPMI 1640 培 养 基( SH30809． 01 ) 和 高 糖 培 养 基( SH30022． 01B) 购自美国 Hyclone 公司; CNBr-Sepharose 4B( GE17-0430-01) 和猪胃黏蛋白 PSM( M2378) 购自美国 Sigma-Aldrich 公司。
1． 2 仪器与设备
Tecan Infinite 200 型多功能酶标仪( 北京东胜创新生物科技有限公司) ; BCM-1000 型生物净化工作台( 上海玻璃仪器厂) ; 3111 型 CO2 培养箱( 美国 Thermo 公司) ; DP10 型倒置显微镜( 日本 Olympus 公司) ;DYY-7C 型电泳仪( 北京市六一仪器厂) ; PD － 1 型冷冻干燥机( 北京博医康实验仪器有限公司) ; Biofuge 22Ｒ型高速冷冻离心机( 德国 Heraeus-Sepatech 公司) ; AKTA purier100 型蛋白纯化系统( 美国 GE 公司) 。
1． 3 黑木耳凝集素的分离纯化
新鲜黑木耳冻干后，称取 10 g 加入到 400 mL 10 mmol·L－ 1的磷酸盐缓冲液( PBS) 中，用搅拌器搅至匀浆，3 000 r·min－ 1、4 ℃离心 30 min，取上清液，4 ℃保存。将黑木耳匀浆用 20%～ 80% ( NH4 ) 2 SO4沉淀，4 ℃静置过夜。8 000 r·min－ 1、4 ℃离心 20 min，取沉淀。沉淀用少量的 PBS 溶解，4 ℃透析、冻干。冻干后测凝血活性和沉淀物质量，以确定提取凝集素的最佳 ( NH4 ) 2 SO4 饱和度。将凝集素粗提物溶解后，9 000 r·min－ 1、4 ℃离心 15 min，上清液与猪胃黏蛋白 － 琼脂糖 4B ( PSM-Sepharose) 在 4 ℃结合 2 h，用 pH 3． 0 的甘
氨酸洗脱。通过 AKTA 蛋白纯化系统观察并收集洗脱产物，最终分离得到黑木耳凝集素。
1． 4 SDS-PAGE 分析
将黑木耳凝集素配成 0． 5 mg·mL－ 1的溶液。配制 12% 的分离胶和 5% 的浓缩胶。经过配胶、上样、电泳、考马斯亮蓝染色及脱色，观察 SDS-PAGE 图，初步判断黑木耳凝集素的纯度以及分子量。
1． 5 糖抑制实验
利用糖抑制实验判断黑木耳凝集素的糖特异性。将 D － 葡萄糖、D － 半乳糖、D － 阿拉伯糖、D － 木糖、D － 甘露糖、D － 果糖、L － 岩藻糖及 L － 鼠李糖配制成 0． 2 mol·mL－ 1的糖溶液，将猪胃黏蛋白配制成2 mg·mL－ 1溶液，然后分别取 30 μL 糖溶液( 或猪胃黏蛋白溶液) 和 30 μL 2% 的兔血红细胞悬液加入到 U型 96 孔板中，作用 1 h 后，观察凝血结果，看上述几种糖和猪胃黏蛋白是否能与兔血红细胞发生凝集反应。
将黑木耳凝集素配成 1 mg·mL－ 1的溶液，取 30 μL 并依次进行二倍稀释，在每个孔中分别加入 30 μL不同的糖溶液和猪胃黏蛋白，在室温下充分反应 1 h 后，加入 30 μL 2% 兔血红细胞悬液，再次室温反应 1 h，观察凝血活性。
将黑木耳凝集素配成 1 mg·mL－ 1的溶液，取 30 μL 并依次进行二倍稀释，在每个孔中分别加入 30 μL不同的糖溶液和猪胃黏蛋白，在室温下充分反应 1 h 后，加入 30 μL 2% 兔血红细胞悬液，再次室温反应 1 h，观察凝血活性。
1． 6 温度依赖性实验
将黑木耳凝集素配成1 mg·mL－ 1的溶液，取100 μg 分别放置在20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴下作用 10 min。分别取 30 μL，放在 U 型 96 孔板中并用 PBS 进行二倍比稀释，加入 30 μL 2% 的兔血红细胞悬液，室温反应 1 h，观察凝血活性。
1． 7 pH 值依赖性实验
配制 pH 缓冲溶液，将其 pH 值分别调至 3． 5、4． 5、5． 5、6． 5、7． 5、8． 5、9． 5、10． 5 和 11． 5 备用。将黑木耳凝集素用 PBS 配成 10 mg·mL－ 1的凝集素母液，再分别用不同 pH 缓冲溶液稀释成 1 mg·mL－ 1的黑木耳凝集素溶液，室温作用 2 h 后，加入 pH 7． 5 Tris-HCl 缓冲液并充分混匀，中和至中性，排除强酸、强碱缓冲液对凝血活性的影响，防止发生溶血反应。取 30 μL 不同 pH 值处理后的黑木耳凝集素溶液，放入 U 型 96 孔板中并用 PBS 进行二倍比稀释，最后加入 30 μL 2% 的兔血红细胞悬液，室温反应 1 h，观察凝血活性。
1． 8 抗肿瘤活性分析
肺癌细胞( A549) 用 1640 培养基、乳腺癌( MCF-7) 用高糖培养基培养到第三代，使细胞处于对数生长期，然后进行抗肿瘤试验。细胞用培养基配成 2 × 106个·mL－ 1的细胞悬液，用移液枪吸取 200 μL 加入 96孔板中培养 24 h。将黑木耳凝集素配成 10 mg·mL－ 1的母液再稀释成 40、20、10、5、2． 5 μg·mL－ 1的含药培养基。将 96 孔板中原有培养基弃掉，分别加入 100 μL 含药培养基，每个样品设制 3 个重复。阳性对照为含有紫杉醇的培养液，阴性对照为含有与药物培养基等量 PBS 的培养液。设制 3 个时间梯度，分别培养 24、48、72 h。到培养时间后，在 96 孔板中每孔加入 10 μL MTT 溶液，培养 4 h 后再用移液枪每孔加入 100 μL 的裂解液，继续培养 4 h 至紫色结晶完全消失后，用 μQuant 微孔板分光光度计在 570 nm 处测定吸光度值。
2 结果与分析
2． 1 黑木耳凝集素的分离纯化
2． 1． 1 不同饱和度( NH4 ) 2 SO4获得的沉淀质量在黑木耳匀浆中加入不同饱和度( NH4 ) 2 SO4进行沉淀，经过透析、冻干后得到粗品凝集素。加入20%～ 80% 不同饱和度( NH4 ) 2 SO4获得沉淀的质量如图 1 所示，可以看出，40% 的 ( NH4 ) 2 SO4获得沉淀的质量最多，其次是 50% 的 ( NH4 ) 2 SO4。将得到的粗品凝集素配成 1 mg·mL－ 1的溶液测凝血活性，结果如表1 所示。由表可知，( NH4 ) 2 SO4饱和度为40% 和50% 时的凝血活性最高，浓度为 125 μg·mL－ 1，饱和度为 20% 、70% 和 80% 时的活性最低，浓度为 500 μg·mL－ 1。综合沉淀的质量和凝血活性两个因素，选择饱和度为 40% 的( NH4 ) 2 SO4进行后续实验。
2． 1． 2 亲和层析纯化和分子质量鉴定
将得到的粗品凝集充分溶解后，与 PSM-Sepharose 在4 ℃下结合。先用 pH 7． 4 PBS 冲掉未与 PSM-Sepharose 结合的杂蛋白，随着 PBS 洗脱体积的增加，杂蛋白越来越少，当吸收值较低且稳定时，改用 pH3． 0 甘氨酸洗脱，洗脱液快速用 pH7． 8 Tris-HCl 中和至中性。如图 2 所示，开始用 PBS 洗脱时，吸收值较高，随着洗脱体积的增加，线条逐渐降低，在 25 ～ 33 管时吸收值基本不变，说明杂蛋白已经洗脱干净。接下来用甘氨酸进行洗脱，随着洗脱体积的增加，洗脱曲线先是逐步上升到达最高点后慢慢降低，最后趋于平稳。将 34 ～ 44 管收集，进行 5 kDa 超滤除盐，在此过程中加水除盐 3 次，换 10 kDa 的超滤离心管，继续超滤浓缩至 500 μL。超滤过程中伴随着凝血活性测定。将得到的产物命名为黑木耳凝集素，对其进行 SDS-PAGE 实验，结果如图3 所示。根据电泳图结果初步推测，黑木耳凝集素的分子量为 25 kDa。
2． 2 黑木耳凝集素性质分析
2． 2． 1 糖特异性实验结果
黑木耳凝集素在不同糖溶液及蛋白溶液作用下的凝血活性结果如表 2 所示。结果显示，D － 葡萄糖、D－ 半乳糖、D － 木糖、D － 甘露糖、D － 果糖和 L － 鼠李糖溶液的凝血活性浓度为 3． 906 25 μg·mL－ 1，与阴性对照活性相同，说明这几种糖对黑木耳凝集素的凝血活性没有抑制作用。D － 阿拉伯糖的凝血活性浓度为62． 5 μg·mL－ 1，L － 岩藻糖的凝血活性浓度为 31． 25 μg·mL－ 1，与阴性对照相比活性降低了很多，因此，可以判断 D － 阿拉伯糖、L － 岩藻糖对黑木耳凝集素的凝血活性具有抑制作用。猪胃黏蛋白溶液的凝血活性浓度为 500 μg·mL－ 1，与阴性对照相比活性很低，说明猪胃黏蛋白对黑木耳凝集素血凝集活性也具有抑制作用，而且是这几种样品中抑制作用最强的。结果最终说明了黑木耳凝集素具有糖特异性。
2． 2． 2 温度依赖性实验结果
将黑木耳凝集素配成 1 mg·mL－ 1溶液后，在 20 ～ 100 ℃不同温度下作用 10 min 测凝血活性，结果如表3 所示。20 ～ 50 ℃处理条件下的凝血活性浓度为 3． 906 25 μg·mL－ 1，与在室温下的活性相同。60 ℃ 温度处理后凝血活性浓度为 7． 812 5 μg·mL－ 1，与室温相比较活性开始降低，到 70 ℃ 温度处理后凝血活性浓度为 62． 5 μg·mL－ 1，活性浓度只有室温时的一半，到 90 ℃时凝血活性完全消失。该结果说明，黑木耳凝集素的凝血活性随着温度的升高而下降，不具有热稳定性，这可能与凝集素自身的结构有关。因为黑木耳凝集素在 50 ℃之后出现活性降低现象，所以选择在 50 ℃下测定不同时间段的凝血活性，结果如表 4 所示。黑木耳凝集素在 50 ℃条件下处理 10 ～ 40 min 后，凝血活性浓度与室温条件下的活性相同; 处理 50 min 时凝血活性浓度开始下降，到 70 min 时凝血活性浓度减半，但 90 min 后凝血活性不再改变，处于平稳状态，凝血活性保持在 125 μg·mL－ 1。这说明黑木耳凝集素在短时间具有温度耐受性，但超过 50 ℃处理 40 min 后，凝血活性降低。这两个实验说明黑木耳凝集素不具有热稳定性。
2． 2． 3 pH 依赖性实验结果
将不同 pH 缓冲溶液处理后的黑木耳凝集素配制成 1 mg·mL－ 1的溶液并测其凝血活性，结果如表 5 所示。pH 值为 3． 5 时，凝血活性浓度为 500 μg·mL－ 1，随着 pH 值的增加，凝血活性逐渐增强，在 pH 值为6． 5 ～ 7． 5时达到最高，凝血活性浓度为 3． 906 25 μg·mL－ 1; pH 值在 7． 5 以上凝血活性逐渐降低，到 pH 值 为 9． 5 时凝血活性完全消失。这说明黑木耳凝集素耐酸性比耐碱性强，不具有酸碱稳定性。
蛋白质结构的稳定性决定生物活性的稳定性，温度和 pH 的凝血活性实验结果表明，黑木耳凝集素不具有热稳定性，耐酸性比耐碱性强，这说明黑木耳凝集素在高温和强酸的情况下凝血活性中心就受到了影响。糖抑制实验结果表明，D － 阿拉伯糖、L － 岩藻糖及猪胃黏蛋白对黑木耳凝集素的凝血活性有抑制作用，其中猪胃黏蛋白的抑制作用最强。但是，黑木耳凝集素的凝血活性的作用机理还需进一步研究，因此，无法依靠糖抑制实验将黑木耳凝集素归于已知凝集素家族。大多数凝集素表面具有特异性糖结合位点，这种特性由凝集素特定的蛋白质结构决定［19］。凝集素主要是以蛋白质或多糖复合物的形式存在，可以发挥重要的作用。通过确定凝集素糖特异性结合位点可以为进一步寻找最佳吸附剂提供科学依据，同时在靶向药物的开发与利用方面也具有重要的意义［20］。
2． 3 黑木耳凝集素抗肿瘤活性分析
2． 6． 1 黑木耳凝集素抗肺癌( A549)
与阴性对照组相比较，加入黑木耳凝集素后，A549细胞逐渐失去原来的无规则多侥型形态，出现气泡化，细胞核逐渐消失。随着黑木耳凝集素浓度和作用时间的增加，细胞体积变大，细胞开始聚集。加入 MTT 试剂检测黑木耳 凝 集 素 抑 制 A549 的 效 果，计算黑木耳凝集素对A549 细胞抑制作用的 IC50值，结果如图 4 所示。黑木耳凝集素对 A549 细胞作用 24、48、72 h 的 IC50 值分别为18． 19、15． 22、11． 39 μg·mL－ 1。随着黑木耳凝集素浓度的增加，A549 细胞的增殖抑制程度逐渐增强; 在相同浓度下，黑木耳凝集素作用时间增加，抑制效果增强。可以看出，随着浓度和作用时间的增加，抑制 A549 细胞的效果逐渐明显，因此可以确定黑木耳凝集素可以抑制 A549细胞。
2． 6． 2 黑木耳凝集素抗人乳腺癌( MCF-7)
与阴性对照组相比较，加入黑木耳凝集素后，MCF-7 细胞形态发生明显变化，正常的形态逐渐消失，细胞体积开始变大变圆。随着黑木耳凝集素浓度和作用时间的增加，这种现象也越来越明显。加入 MTT 试剂检测黑木耳凝集素抑制 MCF-7 的效果，用 SPSS 软件计算黑木耳凝集素对 MCF-7 细胞抑制作用的 IC50值，结果如图 5 所示。不同浓度的黑木耳凝集素对 MCF-7 细胞作用 24、48、72 h 的 IC50 值分别为 19． 70、15． 93、13． 05 μg·mL－ 1。随着黑木耳凝集素浓度的增加，MCF-7 细胞的增殖抑制程度逐渐增强; 在相同浓度下，随黑木耳凝集素作用时间增加，抑制效果增强。可以看出，随着浓度和作用时间的增加，抑制 MCF-7 细胞的效果逐渐明显，因此可以确定黑木耳凝集素可以抑制 MCF-7 细胞。
凝集素的糖结合特性赋予其多种生物学活性，如免疫调节活性［21］、抗肿瘤活性［22］、抗菌活性［23］等。巴西毛果种子凝集素可以抑制人卵巢癌 A2780、肺癌 A549、乳腺癌MCF-7 及前列腺癌 PC3 细胞的增殖［24］，这种凝集素作用卵巢癌 细 胞 24 h 后，可 阻 滞 其 停 留 在 G2 /M 期，并 激 活caspase 9 的表达，延缓细胞凋亡。巴西利马豆凝集素可抑制 83% 的鼠黑素瘤细胞［25］。贻贝凝集素可以促使乳腺癌细胞发生凋亡［26］。本研究发现，黑木耳凝集素对 A549 及MCF-7 肿瘤细胞均有明显的抑制作用，并呈现时间和浓度的依赖性。这为深入研究黑木耳凝集素的抗肿瘤作用提供可靠地的科学依据。
3 结 论
用饱和度为 40% 的( NH4 ) 2 SO4沉淀和亲和层析的方法，从黑木耳中分离纯化出黑木耳凝集素。黑木耳凝集素不具备热稳定性和 pH 稳定性; D － 阿拉伯糖、L － 岩藻糖及猪胃粘蛋白对凝血活性具有抑制作用，其中猪胃黏蛋白的抑制作用最强。黑木耳凝集素对肺癌( A549) 和人乳腺癌( MCF-7) 细胞均有明显的抑制作用，呈现浓度和时间依赖性。但是黑木耳凝集素的空间结构、糖链组成及其抗肿瘤作用的确切机制还不清楚，需要进行更深入的研究。
参考文献
［1］XU S，XU X，ZHANG L． Branching structure and chain conformation of water-soluble glucan extracted from Auricularia auricula-judae［J］． Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60( 13) : 3498 － 3506．
［2］CHEN G，LUO Y C，JI B P，et al． Effect of polysaccharide from Auricularia auricula on blood lipid metabolism and lipoprotein lipase activity of ICＲmice fed a cholesterol-enriched diet ［J］． Journal of Food Science，2008，73( 6) : H103 － H108．
［3］OHIＲI Ｒ C，BASSEY E E． Evaluation and characterization of nutritive properties of the jelly ear culinary-medicinal mushroom Auricularia auriculajudae ( Agaricomycetes) from Nigeria ［J］． International Journal of Medicinal Mushrooms，2017，19( 2) : 173 － 177．
［4］SUN S，ZHANG X，CHEN W，et al． Production of natural edible melanin by Auricularia auricula and its physicochemical properties ［J］． Food Chemistry，2016，196: 486 － 492．
［5］DA SILVA P M，DE MOUＲA M C，GOMES F S，et al． PgTeL，the lectin found in Punica granatum juice，is an antifungal agent against Candida albicans and Candida krusei ［J］． International Journal of Biological Macromolecules，2018，108( 3) : 391 － 400．
［6］刘主，肖仔君，何智丹，等． 草菇凝集素 VL － 2 的分离纯化及其凝血活性研究 ［J］． 江苏农业科学，2015，43( 5) : 273 － 275．
［7］杨爱霞，李应彪，许程剑． 阿魏菇凝集素分离纯化及理化性质的研究 ［J］． 食品与生物技术学报，2014，33( 1) : 34 － 40．
［8］张迪，林勇，杨晓钦，等． 双孢蘑菇 2796 凝集素的提取及其部分理化性质研究 ［J］． 福建农业学报，2011，26( 3) : 457 － 461．
［9］陈建华，孙捷，吕福娇，等． 桑黄发酵液中凝集素 SHL24 的分离与生物活性研究 ［J］． 微生物学通报，2018，45( 2) : 420 － 427．
［10］尹昭晔，孔炯炜，刘湘，等． 柳蘑的化学成分及药理作用研究进展 ［J］． 食用菌，2019，41( 1) : 1 － 3．
［11］CHAKKEＲE SHIVAMADHU M，SＲINIVAS B K，JAYAＲAMA S，et al． Anti-cancer and anti-angiogenic effects of partially purified lectin from Praecitrullus fistulosus fruit on in vitro and in vivo model ［J］． Biomedicing ＆ Pharmacotherapy，2017，96( 11) : 1299 － 1309．
［12］LACEＲDA Ｒ Ｒ E，DO NASCIMENTO E S，DE LACEＲDA J T J G，et al． Lectin from seeds of a Brazilian lima bean variety ( Phaseolus lunatus L． var． cascavel) presents antioxidant，antitumour and gastroprotective activities［J］． International Journal of Biological Macromolecules，2017，95( 2) : 1072 － 1081．
［13］GONDIM A C S，ＲOMEＲO-CANELON I，SOUSA E H S，et al． The potent anti-cancer activity of Dioclea lasiocarpa lectin［J］． Journal of Inorganic Biochemistry，2017，175( 7) : 179 － 189．
［14］PＲASANNA V K，VENKATESH Y P． Characterization of onion lectin ( Allium cepa agglutinin) as an immunommodulatory protein inducing Th1-
type immune response in vitro ［J］． International Immunopharmacology，2015，26( 2) : 304 － 313．
［15］LI Y Ｒ，ZHANG G Q，NG T B，et al． A novel lectin with antiproliferative and HIV-1 reverse transcriptase inhibitory activities from dried fruiting bodies of the monkey head mushroom Hericium erinaceum［J］． Journal of Biomedicine and Biotechnology，2010，2010: 716515．
［16］孙慧，赵辰光，仝鑫，等． 一种新杨树菇( Agrocybe aegerita) 凝集素的纯化及生化特性 ［J］． 中国生物化学与分子生物学报，2003，19 ( 1) : 96 － 102．
［17］张国庆，陈青君，赵爽，等． 红菇属两种凝集素的分离纯化与比较研究 ［J］． 菌物学报，2012，31( 1) : 110 － 118．
［18］林玉满，苏爱华． 牛舌菌凝集素的分离、性质及细胞凝集活性 ［J］． 天然产物研究与开发，2004，16 ( 5) : 420 － 425．
［19］杨雅轩，田勇，唐宇，等． 食用菌功能活性蛋白通过 TLＲs 信号通路的免疫调节作用研究进展［J］． 食品科学，2017，38( 19) : 278 － 284．
［20］黄海涛，李楠，柯国萍，等． 内源凝集素的肿瘤靶向性研究进展 ［J］． 华西药学杂志，2012，27( 3) : 339 － 341．
［21］SOUZA M A，CAＲVALHO F C，ＲUAS L P，et al． The immunomodulatory effect of plant lectins: a review with emphasis on ArtinM properties ［J］． Glycoconjugate Journal，2013，30( 7) : 641 － 657．
［22］LIU Z，LUO Y，ZHOU T T，et al． Could plant lectins become promising anti-tumour drugs for causing autophagic cell death［J］． Cell Proliferation，2013，46( 5) : 509 － 515．
［23］SUN Y Y，LIU L，LI J． Three novel B-type mannose-specific lectins of Cynoglossus semilaevis possess varied antibacterial activities against Gramnegative and Gram-positive bacteria ［J］． Developmental and Comparative Immunology，2015，55( 2) : 194 － 202．
［24］GONDIM A C S，ＲOMEＲO I，NASCIMENTO K S，et al． A potent anticancer metallo-lectin from dioclea lasiocarpa［J］． Journal of Biological Inorganic Chemistry，2017，22( 7) : 179 － 189．
［25］LACEＲDA Ｒ Ｒ E，DO NASCIMENTO E S，DE LACEＲDA J T J G，et al． Lectin from seeds of a Brazilian lima bean variety ( Phaseolus lunatus L． var． cascavel) presents antioxidant，antitumour and gastroprotective activities［J］． International Journal of Biological Macromolecules，2017，95 ( 2) : 1072 － 1081．
［26］LIAO J H，CHIEN C H，WU H Y，et al． A multivalent marine lectin from Crenomytilus grayanus possesses anti-cancer activity through recognizing globotriose Gb3 ［J］． Journal of the American Chemical Society，2016，138( 14) : 4787 － 4795
